Bài này thuộc 1 trong 4 bài của kỹ thuật tái tổ hợp DNA ( Còn gọi là Kỹ thuật DNA tái tổ hợp )
Bài 1: Kỹ thuật tái tổ hợp DNA là gì
Bài 2: Đạt được gen mong muốn
Bài 3: Enzyme giới hạn
Bài 4: Khái niệm và phân loại vector
Bài 5: Kết nối DNA
Men kết nối DNA
Nguồn gốc , tính chất và chức năng của hai loại Enzym nối DNA thường gặp, xem bảng so sánh bên dưới
So sánh hai loại Enzym nối DNA
| Loại enzyme | Enzym nối DNA T4 | Enzym nối DNA E.coli |
| Nguồn gốc | Phage T4 | E.coli |
| Nhân tử phụ trợ | ATP | NAD + |
| 1-đầu dính và đầu bằng hỗ trợ nhau ở phân tử DNA chuỗi kép | ||
| Chất nền | 2- Hybrids RNA –DNA, Điểm đứt trên chuỗi RNA | 1-đầu dính hỗ trợ tương đồng |
| 3-Sợi đơn cắt trong phân tử DNA chuỗi kép | 2-Sợi đơn cắt trong phân tử DNA chuỗi kép | |
| Phạm vi ứng dụng | Rộng rãi nhất | Hẹp |
Cách thức nối
– Cách thức nối (lấy ví dụ men enzyme nối T4 DNA): phương thức nối phân đoạn DNA mục đích và phân đoạn DNA vector có hai loại: nối đầu dính tương đồng, nối đầu bằng và tái bản định hướng. Ba phương thức nối này đều có ưu và khuyết điểm riêng, điều kiện nối cũng khác nhau, xem bảng sau:
Cách thức nối phân đoạn DNA ngoại lai và phân đoạn DNA vector
| Hạng mục | Nối đầu dính tương đồng | Nối đầu bằng | Tái bản định hướng |
| Ưu điểm | Hiệu quả nối cao | 1-có thể nối hai đầu bằng bất kỳ | 1-hiệu quả nối cao |
| 2-có thể hồi phục thậm chí sinh ra điểm cắt mới | 2-Định hướng xen vào | ||
| 3-hạn chế hữu hiệu tự tạo vòng, khi đạt được hoặc sau khi đạt được phân đoạn DNA mục đích, kết nối nó với đầu dính có vector hai đầu dính | |||
| Khuyết điểm | 1-Vector và phân đoạn DNA mục đích tự tạo vòng | 1-Vector và phân đoạn DNA mục đích tự tạo vòng | |
| 2-Chèn hai chiều, chèn nhiều bản sao | 2-Chèn hai chiều, chèn nhiều bản sao | ||
| 3-Hiệu quả nối thấp | |||
| Điều kiện nối | Nhiệt độ thấp (<16 độ)
Men nối nồng độ thấp ATP nồng độ cao |
Nhiệt độ cao (khoảng 20 độ)
Men nồng độ cao và DNA nồng độ cao ATP nồng độ thấp
|
Nhiệt độ thấp (<16 độ)
Men nối nồng độ thấp ATP nồng độ cao |
| Biện pháp khắc phục | Phosphorylation DNA vector | Phosphorylation DNA vector | |
| Chèn số số mol phiên đoạn: số mol vector là 2-3:1 | Chèn số số mol phiên đoạn: số mol vector là 2-3:1 | ||
| Trong hệ thống phản ứng nối thêm vật chất polyethylene glycol nồng độ thấp |
Đầu dính tương đồng là chỉ hai đầu phân đoạn DNA ngoại lai hoàn toàn giống đầu dính bổ trợ lẫn nhau của hai phân đoạn DNA vector, kết nối giữa chúng đọc gọi là kết nối đầu dính tương đồng. Còn tái bản định hướng là phương thức nối định hướng phân đoạn DNA ngoại lai chèn vào phân tử vector, yêu cầu đối với đầu cuối DNA là hai đầu cuối không hỗ trợ nhau trong phân tử DNA vector, mà chỉ có thể liên kết với đầu cuối tương ứng của phân tử DNA ngoại lai. Hiệu quả kết nối giữa các đầu dính tương đối cao, vị trí hai đầu của phân đoạn DNA ngoại lai khác nhau, khi nó chèn vào vector, xác suất hai đầu dính không hỗ trợ nhau trên DNA tuyến tính (vector hoặc phân đoạn DNA ngoại lai) tự tạo vòng giảm đi rất nhiều. Hiện nay tái bản định hướng được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn nhờ tính ưu việt của nó.
