Bài này thuộc 1 trong 4 bài của kỹ thuật tái tổ hợp DNA ( Còn gọi là Kỹ thuật DNA tái tổ hợp )
Bài 1: Kỹ thuật tái tổ hợp DNA là gì
Bài 2: Đạt được gen mong muốn
Bài 3: Enzyme giới hạn
Bài 4: Khái niệm và phân loại vector
Bài 5: Kết nối DNA
Vector là gì?
Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài (gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ mà không gây biến đổi hệ gen của tế bào chủ. Dựa vào mục đích sử dụng có thể chia thành hai loại, vector nhân bản và vector biểu hiện. Căn cứ vào e.coli có thể chia vector nhân bản thành các dạng sau: plasmid, phage, cosmid. Dưới đây giới thiệu về plasmid
Thế nào là plasmid
Plasmid: Các plasmid là những mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn. Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Tùy các kiểu của plasmid mà số bản sao plasmid bởi vi khuẩn sẽ khác nhau. Một số plasmid chỉ có một bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ một lần trong mổi lần phân bào. Một số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản được nhiều lần trong mỗi chu kỳ phân bào. Những plasmid có từ 10 đến 100 bản sao trong tế bào chủ được xem như plasmid có bản sao cao. Plasmid khác có từ 1 đến 4 bản sao trong tế bào chủ, được xếp vào nhóm có bản sao thấp. Trong sinh vật eucaryote, plasmid chỉ có trong tế bào nấm men. Mỗi plasmid đều có một chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức măng tự tái bản DNA. Nếu không có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, DNA không thể tự tái lập trong tế bào chủ. Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vector chuyển gen để nhân dòng DNA cần thiết. Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid không ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng. Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi DNA.
Plasmid tái bản có các đặc điểm sau: Trọng lượng phân tử tương đối thấp, 3-10kb; có tính di truyền chọn lọc; ngoài bản sao chép, còn có rất nhiều điểm cắt ở men giới hạn, tạo thuận lợi cho việc chèn gen ngoại lai; có số lượng sao chép tương đối, plasmid chặt mỗi vi khuẩn có khoảng 1-5 plasmid, plasmid lỏng mỗi vi khuẩn có khoảng 10-200 plasmid tái bản. Plasmid có ít bản sao có thể tăng lên trong chloromycetin medium.
Vector biểu hiện
Vector biểu hiện: Tác dụng của vector biểu hiện chủ yếu dùng đểu biểu hiện protein, chia thành vector biểu hiện nhân sơ và vector biểu hiện nhân thực.
Đặc trưng cơ bản của vector biểu hiện nhân sơ: Hiện nay hệ thống biểu hiện chủ yếu sử dụng e.coli. Vector biểu hiện nhân sơ ngoài các đặc trưng cơ bản của plasmid nói trên, còn có một số yếu tố ko giống. Trong vector biểu hiện, có nhiều yếu tố có liên quan đến biểu hiện protein. Ngoài nhân tử khởi động vi khuẩn, yếu tố quan trọng khác mà DNA tái bản biểu hiện trong e.coli là vị trí kết hợp ribosome hữu hiệu. Trong e.coli, vị trí kết hợp ribosome bao gồm codon ban đầu (ATG) và trình tự DNA có độ dài 9-11 nucleotit trên codon ban đầu (trình tự SD), hỗ trợ nhau tại điểm 3’ của 16SrRNA e.coli. Giữa trình tự SD của mRNA và trình tự 3’ của 16SmRNA hình thành cặp base, từ đó kết hợp ribosome và mRNA. Sau đó dịch mã thành protein. Ngoài ra, cần phải có trình tự chấm dứt transcription, để bảo đảm transcription trình tự chen vào dừng lại kịp thời.
Đặc trưng cơ bản của vector biểu hiện nhân thực: không giống như vector biểu hiện nhân sơ, ngoài những đặc trưng cơ bản của plasmid nói trên, phần lớn vector đều mang gen neo, phosphotransferase (aph) có thể khiến cho G-418 hoặc Puromycin ngừng hoạt động. Một số vector plasmid có mang gen hy8, Encoding hygromycin B phosphotransferase làm Hygromycin ngừng hoạt động. Lợi dụng đặc tính của các gen này để tiếng hành lựa chọn tái bản. Promoter của vector biển hiện nhân thực căn cứ vào tế bào nhân thực khác nhau để lựa chọn promoter tương ứng, Enhancer và ppromoter của trình tự lặp lại đầu cuối của virus Rous sarcoma (LTR) và virut tế bào lớn ở người (CMV) có thể tiến hành tổ hợp ở tế bào chủ, ứng dụng trong vector biểu hiện nhân thực hai tổ hợp này khá rộng rãi. Ngoài ra, enhancer gen đầu của SV40 trong nhiều tế bào của động vật có vú đều cùng có hoạt tính, vì vậy, ứng dụng của enhancer loại này cũng tương đối rộng rãi. Vector biểu hiện nhân thực đều có tín hiệu kết thúc transcription và tín hiệu poly (A).
